关于耐水C18，多的是你不知道的事

  什么是“疏水塌陷”？为什么会发生？

C18柱是反相色谱柱里最通用、使用最广的一种键合固定相。但是众所周知，这种固定相不能在高比例的水相（如>95%）长期使用以免发生“疏水塌陷”，也就是丧失对所有化合物的保留，其原因为固定相的颗粒孔“去湿”（Dewetting）现象所造成。也就是说水相和疏水的固定相表面之间产生高的表面张力，一旦泵停止时流动相会很容易被逐出布满疏水固定相的填料的多孔空间（如图1b）。如果颗粒的孔内不再有液体，固定相和分析物相互接触的机会也减少了，进而造成两者之间相互吸引力的减少，分析物的保留时间自然缩短。

图1 （a）“湿润”状态；(b)“去湿”状态

哪些可以耐纯水？是如何实现的？

在不少情况下，我们需要色谱柱能够耐受纯水，这样可以让起始流动相水相很高甚至纯水相，从而增强出峰更早（即疏水性弱）的化合物的保留。这时我们可能会想到“AQ”（也就是aqua或相关词汇的前两个字母作为缩写）柱，也就是“水柱”。有很多的色谱柱厂家都推出了这类色谱柱，在这些色谱柱的命名中，经常带有比如“Aqua”、“AQ”、“Shield”、“Bonus”、“RP”、“Polar”、“EPS”、“PE”、“PEG” 等，这类色谱柱也成为方法开发的常用工具。这类色谱柱最常见的技术手段都是通过在固定相中引入极性基团（Polar group）来实现耐纯水的（也有通过优化键合密度来实现，但不太主流）。而极性基团的引入有两种方式，一种是把极性基团嵌入（embed）到疏水的烷基链中，另一种是用极性基团封端（end-cap）剩余的硅羟基（如图2）。

图2 引入极性基团的两种方式

 一般会使用哪些极性基团？

由于各大厂家基本都没有公布它们生产的极性封端的固定相所使用的是什么极性基团，因此对于使用这类技术的“AQ”柱，可能各家各有千秋；而对于极性基团嵌入，选择的极性基团一般都是一些氢键受体，比如酰胺（amide）、脲（urea）、氨基甲酸酯（carbamate）（如图3）等。

图3 常见的几种嵌入的极性基团

 为何可以耐受纯水？有哪些其他性能变化？

为什么在疏水的C18类固定相中引入极性基团之后就可以耐受纯水了呢？因为这些基团可以与水形成氢键，从而让固定相表面有部分“吸附水（sorbed water）”，从而降低固定相与水的表面张力，避免发生“疏水塌陷”。但是与此同时，这类色谱柱的疏水作用就会变得更弱一些。

 不同的技术有什么差异？该如何选择？

极性基团封端和极性基团嵌入虽然都可以保证色谱柱可以耐受纯水相，但是这两种技术让色谱柱的选择性的差异不一样。有文献研究了不同技术的AQ柱的选择性，发现极性封端的选择性相比非极性封端的变化不大，但是极性嵌入的会明显改变色谱柱的选择性。因此，我们可以根据具体项目需要而选择不同技术路线的AQ柱。比如当我们使用常规C18开发好了方法，对大部分的分离满意，只是需要耐纯水的柱子来改善前面化合物的分离情况，可以选择极性封端的色谱柱；而当我们发现用常规C18时分离情况很不理想，这时候可以尝试极性基团嵌入的色谱柱，这样可以最大程度地实现选择性的互补。

由Snyder等人提出的“疏水减法模型（Hydrophobic-substraction Model）”是表征反相色谱柱的重要模型：

(i)-(v)分别代表疏水性、空间位阻、氢键酸性、氢键碱性和阳离子交换五种作用。对于极性嵌入的色谱柱，会由于其嵌入基团的差异而造成氢键碱性（也就是其孤对电子接受活泼氢的能力）的差异。具体的排序为：

ether (B = -0.01) < hydroxy (B = 0.05) < carbamate (0.09 ≤ B ≤ 0.10) < PEG (Glycol) (B = 0.15) < urea (0.23 ≤ B ≤ 0.30) ≈ amide (0.22 ≤ B ≤ 0.37)

随着氢键碱性的增强，对氢键酸性化合物的保留也会增强，比羧酸类、酚类等；但同时也会减弱对氢键碱性化合物的保留，如铵类化合物、酰胺类化合物等等，正所谓有得必有失。因此可以根据具体分析物的化合物的氢键酸碱性，来选择合适的极性嵌入的色谱柱来针对性地增强或者减弱保留。

另外，通过引入极性基团，特别是在烷基链中嵌入极性基团时，固定相表面存在一层“吸附水”后，也可以屏蔽掉硅胶表面残留的硅醇基，从而改善碱性化合物由于与硅醇基作用而导致的拖尾。如图4即为酰胺基嵌入的Horizon Amide 18与超惰性的Aurashell Ultra C18在乙腈-磷酸水溶液流动相体系下的图谱对比，可以看到通过嵌入酰胺基，可以明显改善这类季铵型防腐剂的峰形，无需其他复杂添加剂的加入。而胺/铵类化合物是常见的药物有效成分或者中间体以及其他原料成分，往往需要比较极端的pH或者特殊添加剂来改善其峰形问题，因此这类色谱柱也可以成为这类化合物分析的更好的工具。

图4 酰胺基嵌入的Horizon Amide 18与常规C18分析季铵类化合物的图谱对比

 星谱科技可以提供哪些耐纯水的C18？

星谱科技可以提供英国Horizon的全系色谱柱，它在固定相的设计方面非常有技术积累，除了能提供经典耐用的全多孔Horizon C18、核壳技术的Aurashell C18之类，还能提供各种基团修饰的C18，使色谱柱在耐水的同时，提供与常规C18互补的选择性，是方法开发的利器，为用户解决了很多分离和峰形的问题，具体型号和分离机制如下：

参考文献

1.  L.R. Snyder et al. J. Chromatogr. A 1060 (2004) 77-116;

2. U.D. Neue et al. Chromatographia 54 (2001) 169;

3. B. Buszewski et al. Anal. Chem. 69 (1997) 3277;

4. J.E. O’Gara et al. Anal. Chem. 67 (1995) 3809;

5. J.J. Kirkland et al. LCGC North Am. 17 (1999) 634;

6. A. Sandi et al. J. Chromatogr. A 818 (1998) 1;

7. U.D. Neue et al. J. Chromatogr. A 849 (1999) 101;

8. N.S. Wilson et al. J. Chromatogr. A 1026 (2004) 91-100.